ED Santé, Sciences Biologiques et Chimie du Vivant (SSBCV) n°549
1. Informations administratives :
Nom de l’encadrant responsable de la thèse : C. Leterrier
Unité : UMR PRC 85- INRA Centre Val de Loire
Equipe (si unité multi-équipes): Comportement, Neurobiologie, Adaptation
Email de l’encadrant : Christine.Leterrier@tours.inra.fr
2. Titre de la thèse : Influence du microbiote intestinal initial sur les comportements émotionnels et la mémoire chez la caille japonaise.
3. Résumé :
Contexte scientifique :
Le microbiote intestinal (MI) joue un rôle important, connu de longue date, sur l’immunité de son hôte. Depuis quelques années, on découvre qu’il joue également un rôle dans le métabolisme de l’hôte, son développement (Sommer & Backed 2013) et, de manière plus surprenante, sur son comportement, ce qui a conduit à parler d’axe intestin-cerveau. Des études chez la souris ont montré que les animaux axéniques avaient des comportements liés à anxiété modifiés par rapport aux souris ayant un microbiote normal (Heijtz et al 2011, Nishino et al 2013, Crumeyrolle-Arias et al 2014 par exemple). Chez les rongeurs et chez l’Homme l’apport alimentaire de probiotiques, c’est-à-dire de bactéries favorables à la stabilité digestive, réduit les comportements anxieux et certaines altérations du comportement social (Cryan et Dinan 2012 pour revue). Les investigations neurobiologiques menées chez la souris mettent en évidence l’activation de nombreuses structures impliquées dans les comportements émotionnels (Bravo et al 2011). Par ailleurs, certaines bactéries pathogènes produisent des perturbations des processus mnésiques chez la souris (Gareau et al 2011) et nous avons montré que l’administration d’un probiobiotique permet de réduire la réactivité émotionnelle et d’améliorer la mémoire de travail chez la caille (Parois et al 2013). Cet ensemble de connaissances suggère un effet majeur du MI sur les capacités cognitives de l’individu.
Les études réalisées chez l’Homme et les rongeurs montrent que le MI du jeune a une importance déterminante sur la composition du MI de l’adulte. Ainsi, la façon dont l’enfant vient au mode (voie vaginale ou césarienne) et l’alimentation post-natale vont ainsi avoir des conséquences sur la composition ultérieure du MI (Clarke et al 2014 pour revue). Le MI initial a par ailleurs des effets majeurs sur le développement des structures centrales (Douglas-Escobar et al 2013). Cependant, chez le rat, des perturbations du MI initial provoquent des différences de nociception, mais ne révèlent pas de modifications des
comportements anxieux (O’Mahony et al 2014), suggérant que ce rôle du MI initial mérite encore d’amples investigations.
En conséquence, l’hypothèse testée dans la thèse est que le MI initialement implanté dans le tube digestif de l’individu a des conséquences à court et long terme sur ses comportements émotionnels et ses capacités mnésiques.
Le modèle animal
Pour étudier cette question, nous proposons d’utiliser l’oiseau nidifuge car celui-ci permet de contrôler complètement l’environnement microbien de l’embryon et du jeune en maintenant à la fois une naissance naturelle par éclosion et un début de vie qui ne nécessite pas la présence des parents. Actuellement, les études s’intéressant aux mécanismes d’action du MI utilisent des rongeurs issus de parents axéniques de manière à contrôler le MI qui est implanté. Or, l’absence de MI altère le développement cérébral et il est fort possible que ceci ait des conséquences sur le comportement de la mère, alors que chez l’oiseau nidifuge, l’oisillon axénique peut provenir d’une mère au MI normal et peut être élevé sans cette mère.
Programme
Dans ce programme, le travail du doctorant sera centré sur l’analyse des comportements, des effets sur la mémoire et des relations avec le microbiote. L’étudiant pourra participer à la caractérisation du MI, mais celle-ci sera effectuée par des spécialistes du séquençage et du microbiote.
Le principe est d’implanter un MI connu chez des cailleteaux fraichement éclos et de mesurer leur comportement. L’objectif est de :
1- Comparer l’effet de deux MI différents implantés sur des oisillons axéniques de même fond génétique que les oiseaux donneurs. Les deux MI sont rendus différents par des facteurs alimentaires.
2- Echanger le MI de deux lignées génétiques différant par leur comportement et leur MI.
3- Répéter la phase 1 ou 2 dans des conditions d’élevage moins contraignantes que l’élevage en isolateur pour pouvoir étudier les effets sur la mémoire et le développement à long terme. Le choix entre les schémas 1 et 2 (facteur nutritionnel ou facteur génétique) se fera sur la base des résultats comportementaux obtenus.
Etape 1 : Influence de la composition du MI initial sur les comportements émotionnels
Dans cette première étape, on utilise une modification simple du MI, celle obtenue en modifiant l’alimentation des cailles donneuses vis-à-vis du contenu en polysaccharides et en matières grasses. Les cailleteaux sont axéniques et élevés en isolateur de manière à contrôler parfaitement le MI initial. Après l’éclosion, les oisillons de différents isolateurs sont gavés avec un milieu enrichi avec le contenu caecal des cailles ayant reçu l’un ou l’autre des régimes alimentaires. L’activité spontanée est mesurée dans l’isolateur (posture, comportement social et alimentaire). Après la sortie de l’isolateur (5 semaines), sont mesurés la croissance, la réactivité de l’axe corticotrope et les comportements émotionnels positifs et négatifs (tests de réactivité et d’expression des comportements de confort et des interactions sociales). Les MI utilisés pour l’implantation, ceux présents sur les animaux à la sortie de l’incubateur et en fin d’expériences sont caractérisés par séquençage de l’ARN 16s.
Etape 2 : Influence du MI initial et de son interaction avec le génotype de l’hôte sur les comportements émotionnels
Certains effets génétiques sur le métabolisme ont pu être expliqués, au moins en partie, par le MI hébergé par les individus (Tremalori & Bäckhed 2012 pour revue). La question se pose donc de savoir si le MI de l’hôte peut expliquer une partie des facteurs génétiques influençant le comportement de cet hôte. Pour répondre à cette interrogation, les deux MI destinés à la transplantation sont issus de prélèvements caecaux de deux lignées de cailles dont les comportements émotionnels sont différents et le MI également. Les MI sont échangés chez les cailleteaux expérimentaux et les témoins reçoivent le MI de leur lignée. Les conditions d’élevage (axénie, isolateur) sont les mêmes que dans la première étape, de même que les mesures réalisées.
Etape 3 : Influence de la composition du MI initial sur la mémoire.
L’objectif est de mesurer l’influence du MI initial sur les processus mnésiques. Le schéma expérimental est le même qu’en phase 1 ou 2, mais le principe de cette étape 3 est d’utiliser des conditions semi-contrôlées, moins contraignantes, pour un phénotypage plus facile, en plus grand nombre et surtout pour pouvoir réaliser les tests d’apprentissage qui nécessitent un grand nombre d’individus et des dispositifs complexes. Les cailleteaux éclosent dans des conditions aseptisées, puis ils sont mis au contact des différents MI dans des enceintes évitant au maximum les contaminations extérieures. Les mesures réalisées dans l’étape 1 sont répétés ici et une partie des animaux est soumise à un test mettant en jeu la mémoire à court terme tandis que l’autre est testée vis-à-vis de sa mémoire à long terme. Les MI sont analysés aux mêmes périodes que dans l’étape 1.
Résultats attendus
Nous espérons pouvoir tester notre hypothèse de travail et ainsi savoir quelle importance a le MI initial dans la modulation à court et long terme des comportements émotionnels et de certains processus mnésiques. Une réponse sur ce point permettra de mieux positionner les travaux ultérieurs en nous indiquant à quel point les conséquences de variations du MI qui interviennent tardivement dans la vie de l’hôte sont bornées, ou non, par la structure du MI initial.
Des résultats sont également attendus en élevage car les perturbations intestinales sont très fréquentes, en particulier dans le jeune âge. Lorsqu’ils sont extrêmes, ces troubles ont des conséquences connues à long terme sur la croissance et la capacité à digérer les aliments, cependant les conséquences comportementales sont inconnues une fois passée l’épisode d’expression clinique de la maladie. En élevage avicole, les connaissances sur le MI sont croissantes, néanmoins, aucun travail ne semble avoir été effectué sur les effets du MI sur le comportement des volailles, pourtant certains comportements sont très délétères comme les réactions de peur ou le picage des plumes où les oiseaux ont tendance à arracher les plumes de certains de leurs congénères. S’il est confirmé que le MI initial a une influence sur les comportements ultérieurs et les capacités d’adaptation des oiseaux d’élevage, il se présenterait alors une nouvelle voie d’amélioration de l’élevage des animaux, soit par l’apport de probiotiques aux oisillons, soit en leur fournissant une alimentation favorisant la flore intestinale n’entrainant les comportements délétères.
Collaborations impliquées dans le projet de thèse
L’élevage en isolateur pourra être réalisé au niveau de plate-forme MICALIS en collaboration avec S. Rabot qui a déjà l’expérience de l’élevage des cailles en isolateurs car cet oiseau est utilisé comme modèle de certaines entérites du nouveau-né humain.
Le microbiote caecal pourra être analysé par séquençage de l’ARN 16s (Collaboration avec l’unité INRA GenPhySE, la plate-forme de séquençage de l’ANSES de Ploufragan et l’unité INRA de Recherche Avicole). Si des simplifications sont possibles, dans le cas de la mise en
évidence d’acteurs bactériens candidats pour expliquer certains traits comportementaux et/ou développementaux, alors nous pourrons utiliser une caractérisation simplifiée par PCR.
4. Résumé en anglais :
Influence of the initial gut microbiota on behavior and memory in the Japanese quail
Scientific background
The gut microbiota (MI) plays a major well-known role on immunity of its host. Some years ago, it has been also discovered that it plays also a role on host metabolism, development (Sommer & Backed 2013), and even on host behavior, which led to the gut-brain axis concept (Cryan et Dinan 2012). Emotional behavior is especially modulated by the gut microbiota, presently called microbiome (MI). This concept has been strengthened by experiments using germ-free mices, the provision of probiotics to rodents and humans (Bravo et al 2011, Heijtz et al 2011, Nishino et al 2013, Crumeyrolle-Arias et al 2014). Differences in memory have also been related to differences in MI (Gareau et al 2011, Parois et al 2013).
Studies carried out in humans and rodents showed that the initial MI that is received at birth will largely influence the MI composition when adult (Clarke et al 2014 pour revue). Moreover MI will have a major influence on brain development (Douglas-Escobar et al 2013).
Consequently we want to test the following hypothesis: the initial MI has short and long-term consequences on the emotional behaviors and the cognitive abilities of the host.
The animal model that will be used is a nidifugous bird since it enables normal early life in germ-free conditions while a mammalian germ-free new-born needs maternal care from a germ-free mother whose behavior and metabolism may be sub-optimal because the mother also had to grow up in germ-free conditions.
Programme
The doctoral study will be focused on behaviour, memory and their relationship with MI. The student will participate to the MI characterization but this part will be led by experts in sequencing and in microbiota.
The leading principle will be to implant a controlled MI to germ-free quail chicks after hatch and to measure their behavior. The aim will be:
1- To compare the effects of two different MI that will be implanted to chicks that will have the same genotype background as the quail that will provide the MI. Both MI will be made different through nutrition of the quail.
2- To exchange MI between two lines of quail which differ for their behavior and their MI.
3- To repeat the phase 1 or 2 in rearing conditions that will be only semi-controlled in order to be able to study the effects on memory and the long-term effects on development. The choice between design 1 or 2 (nutritional or genetic factor) will be achieved according the results obtained for behavior.
The first step: Influence of the MI composition on emotional behavior.
During the first step, we will use a simple modification of the MI, obtained through polysaccharide and fat changes in the diet given to the quail that will provide the MI for the chicks. The quail chicks will be germ-free and reared in an isolator. Chicks from different isolators will be forced-feed with a medium enriched with one or the other caecum MI. Activity is measured in the isolator. After the birds have been retired from the isolator (5
weeks of age), growth and reactivity of the HPA axis will be measured and positive and negative emotional behaviors will be quantified in various tests. The MI will be analyzed by 16s sequencing before implantation, at the end of the isolator stage and at the end of the experiment.
The second step: Influence of MI and of its interaction with the host genotype on behavior
Some genetic effects on metabolism have been explained, at least part of them, by the effect of MI (Tremalori & Bäckhed 2012 for review).We can the wonder whether the host’s microbiota can explain part of the genetic factors that influence behavior. To answer to this question, two types of MI will be implanted to germ-free quail chicks that have hatched in an isolator. Both MI will be extracted from the caeca of quail from two genetic lines that differ in their behavior and in their MI. The control birds will receive the MI from their own lines while the experimental will received the MI from the other line. The measures carried out in phase 1 will also be achieved and the MI will be analyzed as planed in phase 1.
The third step: Influence of the initial MI on memory
The aim of this phase is to investigate the influence of the initial MI on memory processes. The experimental design will be the same as in step 1 but the axenic conditions will be alleviated in order to make the behavior measurements easier and to help measuring more birds, since learning tests need many individuals. Quail chicks will hatched in germ-cleaned boxes equipped as cages but designed to avoid bacterial contamination and they will get in touch with the various MI in these boxes . The measures carried out in phase 1 will also be achieved in this third phase and part of the animals will be submitted to a short-term memory test while the other will be tested for long-term memory. The MI will be analyzed as planed in phase 1.
5. Thèses encadrées au cours des 4 dernières années (par l’encadrant et l’éventuel co-encadrant) :
1. Nom du doctorant : Julien Recoquillay
Encadrant responsable de la thèse : E. Le Bihan-Duval (et co-encadrement : C. Leterrier)
Date de début - date de soutenance : 1-10-2011 au 12-12-14
Financement de la thèse : INRA Département Génétique Animale
Publications de l’étudiant en 1er auteur :
Recoquillay J, Leterrier C, Calandreau L, Bertin A, Pitel F, Gourichon D, Vignal A, Beaumont C, Le Bihan-Duval E, Arnould C. (2013) Evidence of Phenotypic and Genetic Relationships between Sociality, Emotional Reactivity and Production Traits in Japanese Quail. PLoS ONE 8(12): e82157. doi:10.1371/journal.pone.0082157
Recoquillay J, Pitel F, Arnould C, Leroux S, Dehais, Moréno C, Calandreau L, Bertin A, Gourichon D, Bouchez O, Vignal A, Fariello MI, Minvielle F, Beaumont C, Leterrier C, Le Bihan-Duval E. (2014) Use of a medium-density SNP panel allows detecting new QTL for sociality, emotional reactivity and production traits in Japanese Quail. BMC Genomics (accepté pour publication).
Brevets : NON
Devenir de l’étudiant après la thèse : Recherche de post-doctorat
6. Thèses en cours (par l’encadrant et l’éventuel co-encadrant) : Aucune
7. Cinq publications principales ou brevets de l’encadrant (et de l’éventuel co-encadrant) au cours des 4 dernières années :
1. Calandreau L, Bertin A, Favreau-Peigne A, Richard S, Constantin P, Lansade L, Arnould C, Leterrier C. (2013) Impact of high and low anxiety trait on object habituation and discrimination: Evidence from selected lines of Japanese quail. Behavioural Brain Research 250: 299-303.
2. Recoquillay J, Leterrier C, Calandreau L, Bertin A, Pitel F, Gourichon D, Vignal A, Beaumont C, Le Bihan-Duval E, Arnould C. (2013) Evidence of Phenotypic and Genetic Relationships between Sociality, Emotional Reactivity and Production Traits in Japanese Quail. PLoS ONE 8.
3. Favreau-Peigne A, Calandreau L, Constantin P, Gaultier B, Bertin A, et al. (2014) Emotionality Modulates the Effect of Chronic Stress on Feeding Behaviour in Birds. PloS ONE 9.
4. Laurence A, Lumineau S, Calandreau L, Arnould C, Leterrier C, et al. (2014) Short- and Long-Term Effects of Unpredictable Repeated Negative Stimuli on Japanese Quail's Fear of Humans. PloS ONE 9.
5. Recoquillay J, Pitel F, Arnould C, Leroux S, Dehais, Moréno C, Calandreau L, Bertin A, Gourichon D, Bouchez O, Vignal A, Fariello MI, Minvielle F, Beaumont C, Leterrier C, Le Bihan-Duval E. (2014) Use of a medium-density SNP panel allows detecting new QTL for sociality, emotional reactivity and production traits in Japanese Quail. BMC Genomics (accepté pour publication).
8. Principaux contrats de recherche obtenus par l’encadrant (et l’éventuel co-encadrant) au cours des 4 dernières années :
ANR EmoFarm (2010-2013) : Emotions in Farm Animals
ANR SNP-BB (2010-2013) : SNP-Mapping for behavioural traits in Bird
WHELP, Welfare-Health in Early Life Programme, Métaprogramme Gestion Intégrée de la Santé Animale (financement INRA, 2014-2016)
